什么是NGS目标富集?为什么它很重要?

2020年2月06 罗氏公司

下一代测序(NGS)在几天内使能大规模排序(序列的序列最多)1它还大大降低了测序的成本。2这次和节省成本可以对全基因组进行测序,这是研究人员的有吸引力的选择。bob下载地址然而,即使NGS的进展,整个基因组测序(WGS)仍然是昂贵的,需要更多的测序产率和试剂,3.产生必须仔细审查和解释的大量数据,并产生在数据解释中调和相关的不确定性的需要。因此,只有与特定疾病相关的编码区或特定基因或染色体的特定基因或细分的靶向测序具有几个优点。

作为一种聚焦测序方法,靶向测序提供了聚焦特定疾病相关基因或其他感兴趣的特定基因的能力。使用这种方法,整个基因组的其余部分可以忽略不计,简化了下游生物信息学分析,并提供了获得更深入覆盖的能力。3.覆盖深度(覆盖冗余)事项,因为它可以提高基础呼吁对变体分析的信心。4.目标富集是样品制备的一个添加步骤,是目标测序所需要的,可以通过多种技术来实现。在这篇文章中,我们将探讨NGS的靶富集是什么,探索不同的靶富集策略,并理解为什么靶富集对不同疾病领域的研究很重要。bob下载地址

靶蛋白富集-捕获NGS感兴趣的选择性基因组区域

有几种靶向富集的方法可用。选择使用的方法取决于各种参数,例如成本,易用性以及可用的样品输入量。5.敏感性、特异性、覆盖的均匀性和再现性是关键的度量标准,它们也可能在选择目标富集度量中起到一定的作用。一些关键的靶标富集方法是基于杂交和pcr的靶标富集方法。在最初的杂交方法中,依赖于用385,000个探针在单个微阵列上捕获固体表面的DNA。6.尽管后来的版本具有更高的高级功能,因此由于需要大量的DNA和昂贵的硬件,并且其有限的吞吐量,基于阵列的方法比随后开发的基于解决方案的捕获方法变得不那么受欢迎。基于溶液的杂交方法如下所述。

杂交捕获目标富集

在捕获方法中,DNA被片段化(通过物理剪切或酶切方法),并通过添加特定于所使用的测序平台的适配器来准备测序,这些适配器通常作为以后识别的条形码。然后将制备的DNA与单链寡核苷酸杂交(探针或诱饵,旨在针对特定的兴趣区域)。通常,这些探针是生物素化的,可以使用链霉亲和素包被的磁珠进行回收,该过程可以用于捕获珠子复合体中的目标DNA。该方法使用与微阵列相同的原理,但不是在微阵列上杂交,而是在杂交溶液中与捕获探针实现捕获。7.与探针相比,基于阵列的系统使用更多的模板DNA,而基于溶液的方法使用更多的探针,大大减少了样本需求,更好地捕获成功。5.

基于PCR的目标富集策略

与基于捕获的技术相比,基于扩增子的或基于PCR的技术使用引物来扩增特定的感兴趣区域。在PCR反应中使用成千上万的引物对,使得能够同时靶向几个感兴趣区域并需要有限的DNA输入。一旦产生了扩增子,它们以等摩尔量汇集并准备通过适配器连接过程进行测序。多路复用PCR产生多个扩增子也是可能的。液滴PCR的最新进展使得能够将DNA分子分解为数千个液滴并在单个液滴中进行独立的PCR反应。基于PCR的方法的优点是其易用性,准确的定量和它所提供的高敏感性。8.然而,由于引物和试剂的成本以及大DNA输入量的要求,PCR基富集方法可能不是靶向非常大的基因组区域。5.

使用分子反转探针的靶向富集(MIP)

MIPs最初是用于SNP检测的,它使用的是带有共同连接体的单链寡核苷酸,两侧是靶向特异性探针。核苷酸退火到目标序列,并被连接酶环化,随后进行PCR扩增。DNA聚合酶用于填补靶特异性MIP序列之间的空白,以捕获特定片段,如外显子。在某些情况下,探针的一端被生物素化,这样它就可以被链霉亲和素包裹的磁珠捕获。MIP方法是捕获少量目标的理想方法。7.基于mip的靶标富集适用于样本量大、靶标数量少的情况。与杂交方法相比,该方法的主要缺点是捕获均匀性较差。8.此外,当需要获得大量MIP寡核苷酸以覆盖更大的目标时,这种方法可能会变得昂贵。8.

目标富集方法的优点和应用

虽然每种富集方法都有自己的优缺点,但目标富集总体上有几个优点。为了在基因变异发现研究中获得预期的阅读深度和覆盖的均匀性,目标富集是非常有利的。利用目标富集方法可以最大限度地实现对目标读和对基因组对齐的读。有了不同供应商提供的针对个别疾病的专门小组,时间和测序工作就可以集中在研究感兴趣的特定疾病领域。bob下载地址一些目标面板也可以定制,使关注感兴趣的区域更容易。有针对性的方法也有利于研究未知意义的变量,因为分析可以集中在有限的数据量。

丰富的利息地区导致增加投资回报

全基因组分析和靶向测序之间的成本差异似乎变得模糊,实施“全基因组”和“靶向”方法之间的困境似乎激增。然而,全基因组分析产生的大量数据增加了复杂性,解读数据的不确定性导致了有针对性的方法的明显优势。随着预期目标的丰富和测序深度的实现,可以获得更多的清晰度和更有用的信息。最终,采取哪种方法仍然取决于当前的具体问题,以及对专注于特定区域是否有意义的评估。有了今天可用的技术,目标浓缩方法仍然会为你的投资提供更多的回报。

参考文献

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  8. 关键词:核酸变异,PCR,杂交,NGS方法Advanced Drug Delivery Reviews. 2016.105:3-19